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蓯蓉提取物中松果菊苷、毛蕊花糖苷、 半乳糖醇、 甜菜堿及可溶性多糖測定
作者:劉玲  轉載自:天然植物提取物  發布日期:2018-05-20


亚美AM8肉蓯蓉為列當科植物肉蓯蓉Cistanchedeserticola  Y. C. Ma或管花肉蓯蓉Cistanchetubulosa (Schenk) Wight的干燥帶鱗葉的肉質莖"。前者習稱“軟大蕓”,為歷史悠久的名貴道地藥材,內蒙古阿拉善盟為其道地產區2]。本品具有補腎陽、益精血、潤腸通便之功效3],《本草綱目》記載“此物補而不峻,故有從容之稱”4,肉蓯蓉中的“肉”體現了本品肥厚質潤的性狀特征,“蓯蓉”表達了發揮功效的特點。肉蓯蓉活性成分豐富,主要含有苯乙醇苷類[5]、環烯醚萜類、揮發性成分、生物堿、多糖、甜菜堿等成分0],其中松果菊苷和毛蕊花糖苷屬于苯乙醇苷類成分,是《中國藥典》2015年版規定的指標成分,苯乙醇苷類具有補腎陽、神經保護等作用;多糖類具有提高免疫力、延緩衰老等作用;甜菜堿具有保肝、抗腫瘤的作用;半乳糖醇具有潤腸通便的作用。肉蓯蓉為瀕危物種,自然資源長期匱乏,遠遠無法滿足當前市場需求,自2010年起,內蒙古阿拉善盟左旗蘇海圖基地栽培肉蓯蓉寄主植物梭梭200.10km?,并接種33.35 km? 肉蓯蓉,有效緩解了市場的供需矛盾。由于本品活性成分復雜,功效主治較多,為了更客觀揭示本品的道地品質特征,本研究擬以道地藥材的臨床療效和本草學為基礎,充分重視中藥的藥效物質基礎和關鍵活性物質的確定,逐步建立與肉蓯蓉藥材的功能主治相關的整體質量評價體系。因此,本研究以阿拉善盟所產肉蓯蓉為研究對象,基于春、秋2個采收期和5種功效成分松果菊苷、毛蕊花糖苷、半乳糖醇、甜菜堿、可溶性多糖以及浸出物量,進行較全面考察和分析,為進一步揭示肉蓯蓉整體質量特征和道地性品質內涵提供數據支撐。


亚美AM81 材料與儀器1.1 材料


亚美AM8樣品于春季(2015-05) 和秋季(2015-10) 采集于內蒙古阿拉善左旗蘇海圖肉蓯蓉種植基地,分別編號為1~3,接種3年,經天津中醫藥大學李天祥教授鑒定為列當科植物肉蓯蓉Cistanchedeserticola Y. C. Ma。樣品經流水洗凈,去除泥沙,室內陰干,再于55 "C烘千至恒定質量,粉碎,過4號篩,備用。


1.2 儀器與試劑


美國Alltech 1500 系列高效液相色譜儀,配置B05型高壓梯度泵、UV1000型全波段可編程紫外可見檢測器、2000ES型蒸發光散射檢測器、CSChromPlus色譜工作站; UV-610OPCS型紫外可見分光光度計, YHG-600-BS-II型遠紅外快速干燥箱; XMTD-4000 型二:列四孔智能水浴鍋, KDM型調溫電熱套,R-1001N 旋轉蒸發儀,FA2104電子天平;甲醇、乙腈(色譜純),移液槍,甲酸(色譜純),95%乙醇、無水乙醇(分析純),硫酸(分析純),蒽酮(分析純),娃哈哈純凈水;對照品松果菊苷(批號MUST14080710)、甜菜堿(批號MUST-14080710)、無水葡萄糖(批號MUST-14080710),質量分數均大于98%; 對照品毛蕊花糖苷(批號PM0321SA14)、半乳糖醇(批號SS0905HA14) ,質量分數均大于98%。


2 方法


亚美AM82.1 松果菊苷及毛蕊花糖苷的測定


2.1.1 對照品溶液的制備 依次精密稱定松果菊苷和毛蕊花糖苷對照品2.2、0.12 mg,加入50%甲醇定容至10mL量瓶中,即得含0.22 mg/mL松果菊苷和0.012 mg/mL毛蕊花糖苷的混合對照品溶液。


亚美AM82.1.2 供試品溶液的制備 取藥材干燥粉末1.000g,精密稱定,置于100mL棕色量瓶中,精密加入50%甲醇50mL,密塞,搖勻,稱定質量,浸泡30 min后,超聲40min(功率250W,頻率35kHz),取出放涼,再稱定質量,補質量,靜置,取上清液,0.45um微孔濾膜濾過,取續濾液,即得松果菊苷、毛蕊花糖苷供試液。


2.1.3 色譜條件 色譜柱Agilent ZORBAX EclipsePlusC18柱;流動相甲醇(A) -0.1%甲酸水溶液(B)梯度洗脫,0~15min,32%A;15~18min,32%~34%A;18~37min,34%A;37~40min;34%~32%A;40~50min,32%A;體積流量1mL/min;洗脫時間50min;檢測波長334nm;進樣量10uL。


2.2 半乳糖醇的測定


2.2.1 對照品溶液的制備 精密稱定半乳糖醇對照品3.9 mg,加入50%甲醇定容至10mL量瓶中,得含0.39mg/mL半乳糖醇的對照品溶液。


2.2.2 供試品溶液的制備取藥材干燥粉末 1.000g,精密稱定,置于250mL三角瓶中,精密加入50%甲醇100mL,密塞,搖勻,稱定質量,浸泡30 min后,超聲40 min,取出放涼,轉移定容至100 mL量瓶中,吸取0.4 mL供試液,稀釋至25 mL棕色量瓶中,0.45 yum 微孔濾膜濾過,取續濾液,即得供試品溶液。


亚美AM82.2.3 色譜條件 色譜柱Diamonsil Cg柱;流動相為乙腈-水(90: 10); 體積流量0.5 mL/min;蒸發光檢測器;漂移管溫度80 C;載氣體積流量2.4 L/min;洗脫時間10 min;進樣量5 pL。色譜圖見圖2。


2.3 甜菜堿的測定


2.3.1 對照品溶液的制備 精密稱定甜菜堿對照品1.2mg, 加入80%甲醇定容至10mL量瓶中,即得質量濃度為0.12 mg/mL葡萄糖對照品溶液。


亚美AM82.3.2 供試品溶液的制備  取藥材干燥粉末0.100g,精密稱定,置于100mL三角瓶中,精密加入80%甲醇40mL,密塞,搖勻,稱定質量,浸泡20 min后,超聲30min, 取出放涼,補充質量,靜置,取上清液,0.45 yum微孔濾膜濾過,取續濾液,即得甜菜堿供試品溶液。


2.3.3 色譜條件 色譜柱Venusil XBP NH2柱; 流動相為甲醇-0.1%甲酸水溶液(80 : 20);體積流量0.6 mL/min:蒸發光檢測器:漂移管溫度90 "C:載氣體積流量2.2 L/min;洗脫時間15 min; 進樣量10pL。色譜圖見圖3。


2.4 可溶性多糖的測定 


2.4.1 對照品溶液的制備 取無水葡萄糖對照品6.2 mg精密稱定,加入蒸餾水定容至10mL量瓶中,即得含0.62 mg/mL葡萄糖對照品溶液。


亚美AM82.4.2 供試品溶液的制備 取肉蓯蓉藥材干燥粉末1.000 g,精密稱定,置于250mL圓底燒瓶中,向其加入95%Z醇50mL水浴回流2次,每次1h,濾過,棄去2次濾液,回收濾渣,濾渣加水50mL,回流2次,每次2h,濾過,合并2次濾液,活性炭脫色后轉移定容至100 mL量瓶中,取1 mL溶液稀釋至50 mL量瓶中即得多糖供試品溶液。


亚美AM82.4.3 檢測條件 取0.200g蒽酮,精密稱定,濃硫酸定容至100 mL量瓶中,即得。取供試品溶液2mL, 加入至50mL具塞試管中,冰水浴中緩慢滴入5 mL硫酸蒽酮,搖勻,置于沸水浴中10 min,取出,冰水浴冷卻后,以蒸餾水做空白對照,626 nm下測得吸光度(A)值,并根據A值計算多糖量。


亚美AM8W=(CX 50X 100)/樣品質量X1000


W為多糖量,C為樣品無水葡萄糖的質量濃度


2.5 浸出物的測定


亚美AM8取供試品4.000g,精密稱定,置于250 mL錐形瓶中,精密加入稀乙醇(取529 mL無水乙醇,加水稀釋至1000mL,即得49.5%~50.5%Z醇的溶液)100mL,密塞,冷浸,前6 h內振搖,再靜置18h,用干燥過濾裝置迅速濾過,取續濾液20 mL置于干燥至恒定質量的蒸發皿中,放于水浴鍋上蒸干,蒸干后在放置于105 C的烘箱中干燥3 h,取出后靜置于干燥器中冷卻30 min,稱定質量,以干燥品計算醇溶性浸出物量。


2.6 方法學考察


2.6.1 線性關系考察 精密量取松果菊苷、毛蕊花糖苷、半乳糖醇、甜菜堿、無水葡萄糖對照品各6份,按照一定比例稀釋,配成系列對照品溶液,注入高效液相色譜儀及紫外可見分光光度計,測定,以峰面積或A值(Y)對質量濃度(X)作標準曲線,計算得到5種成分標準曲線,結果見表1。


亚美AM82.6.2 精密度試驗 精密吸取各對照品溶液適量,按上述各色譜條件重復6次,測定各自峰面積及A值,RSD分別為0.34%、0.58%、0.91%、1.16%、0.04%。結果表明儀器精密度良好。


亚美AM82.6.3 重復性試驗 精密稱定1號(春)樣品粉末1.000g各6份,分別按各供試品溶液制備項下制備供試品溶液,注入液相色譜儀,測定各自峰面積,可溶性多糖應用紫外可見分光光度法在626nm下測定A值,RSD分別為1.52%、1.88%、1.51%.0.40%、0.98%。結果表明方法重復性良好。


亚美AM82.6.4 穩定性試驗 精密吸取1號(春)樣品各供試品溶液適量,注入液相色譜儀中,測定0、1. 2、3、4、5h下的峰面積,RSD分別為1.98%、1.69%、1.90%、2.27%,表明樣品溶液在5h內穩定。可溶性多糖供試品溶液應用紫外可見分光光度法在626nm下測定A值,測定0、0.5、 1.0、1.5、2.0、2.5h下的A值,RSD為0.03%,表明樣品溶液在2.5 h內穩定性良好。


2.6.5 加樣回收率試驗 精密稱取樣品6份,分別加入相應對照品即松果菊苷1.92 mg、毛蕊花糖苷0.14 mg、半乳糖醇0.29 mg、甜菜堿1.72 mg、無水葡萄糖1.50 mg,按各供試品溶液制備項下制備供試品溶液,注入液相色譜儀及紫外可見分光光度計中,測定各自回收率為98.59%、98.85%、102.19%、100.78%、99.10%,RSD為1.10%、1.16%、1.29%、0.46%、2.02%。結果表明方法可行。


2.7 樣品測定


亚美AM8取不同來源的肉蓯蓉樣品,每批取3份樣品,按各供試品溶液制備項下制備供試品溶液,再按各成分色譜條件項下進行指標成分的測定,重復測定3次,取其算術平均值。結果見表2。《中國藥典》2015 年版規定肉蓯蓉中指標成分松果菊苷及毛蕊花糖苷=者總量不得小于3.0 mg/g。由表2可知,春季、秋季采收樣品二者總量均達到藥典規定水平,且春季量較高,達12.21 mg/g, 是秋季樣品的3倍多,為《中國藥典》2015 年版規定量的4倍。基于松果菊苷,春季、秋季樣品中的累積量相當,無顯著性差異,表明春、秋季的藥材中松果菊苷量波動不大,相當平穩。基于毛蕊花糖苷,春季樣品顯著高于秋季樣品,約是秋季的30倍,表明毛蕊花糖苷累積量波動極大。根據相關文獻報道,松果菊苷和毛蕊花糖苷含有量不僅在肉蓯蓉屬中不同種之間有明顯差異,在同種的不同個體7和不同部位8的量差異也極其明顯;基于甜菜堿,春季樣品量顯著高于秋季。由此可見,毛蕊花糖苷、甜菜堿這2種功效成分,春季出產藥材成分量遠遠高于秋季。基于半乳糖醇,秋季樣品量顯著高于春季樣品,豐富的半乳糖醇是本藥材具有較強的潤腸通便作用的物質基礎!9]。基于可溶性多糖,春、秋季樣品多糖量均處于較高量水平,尤其是秋季采集藥材高達13.7%,同時,也為肉蓯蓉具有較強提高人體免疫力和抗氧化(10-12]等作用提供了有力依據。基于浸出物,秋季樣品量明顯高于春季采收。


3 討論


本研究是基于肉蓯蓉補腎陽、提高免疫力、潤腸通便及現代研究成果保肝等5大主要藥效的功能物質,對道地產區出產的肉蓯蓉中松果菊苷、毛蕊花糖苷、半乳糖醇、甜菜堿、可溶性多糖及浸出物進行定量考察,較全面地反映了道地產區栽培品肉蓯蓉的內在質量。


3.1 肉蓯蓉道地性內在品質特征及其對應的物質基礎,并根據其品質特征,建議增加多糖作為評價其質量特征的指標成分,肉蓯蓉是一味運用2000多年歷史的道地藥材,具有豐富的道地文化內涵。經典本草記載“以條粗壯,質柔潤者為佳”的內在品質特征!I3],而質硬,柴性者次。筆者曾在道地產區阿拉善盟肉蓯蓉藥材市場發現,當地認為質優價貴者稱為“油蓯蓉”。據文獻報道[l4], 內蒙古,新疆南部、北部3地所產的肉蓯蓉,總糖及多糖的量以內蒙古所產最高,且認為內蒙古所產者最優。本研究結果表明,肉蓯蓉含有豐富的可溶性多糖和半乳糖醇,尤其秋季采收樣品的量更高,分別達13.7%、19.5%,兩者均為肉蓯蓉的主要功效成分,豐富的肉蓯蓉多糖和半乳糖醇是本品發揮臨床療效的物質基礎,而二者的存在,與外觀上呈現“油亮、體重、肥厚、質柔潤、味甘”性狀特征相吻合,這也進一步揭示了肉蓯蓉藥效成分與藥材品質形成的內在聯系。《中國藥典》2015年版對藥材質量進行嚴格規定和控制,有效保證臨床用藥的安全、有效。同時,針對具體中藥材往往規定指標成分的限量,來控制其內在質量,但要求指標成分安全、有效、穩定、可靠。根據考察結果發現,春、秋季樣品中肉蓯蓉多糖量分別為10.46%、13.72%,在2個采收期之間相差僅僅約0.3倍,也就是說不同批次間多糖具有量高、波動小、個體間穩定性強、易控制的特點,并且半乳糖醇與其累積量有極強的相關性,因此建議將多糖作為肉蓯蓉的指標成分之一,不但控制了調節免疫功能活性成分多糖的量,間接也反映潤腸通便成分半乳糖醇的量,且能較全面地體現肉蓯蓉的整體質量水平。


3.2 藥典中收載的2種肉蓯蓉差異較大,需建立更加客觀的質控標準。《中國藥典》2015 年版收載肉蓯蓉和管花肉蓯蓉兩種藥材,由于二者基原不同,在性狀特征、成分量及主治作用方面存在差異性。因此,如何建立客觀的質控標準比較困難。首先,基原不同,兩者在性狀特征上也不同。管花肉蓯蓉藥材質地堅硬,不易折斷,斷面呈顆粒狀;而肉蓯蓉質地特征與此恰恰相反,呈現體重、肥厚、質柔韌、易彎曲的性狀特點。其次,兩者在成分量上也存在差異。《中國藥典》2015年版規定管花肉蓯蓉和肉蓯蓉中指標成分松果菊苷及毛蕊花糖苷二者總量分別是不得小于1.5%和0.3%,兩者限量相差5倍。根據本研究結果和相關研究資料表明,肉蓯蓉中的松果菊苷及毛蕊花糖苷二者量較低且不穩定,春、秋兩季樣品成分量相差約3倍,秋季樣品量更低,總量為0.35%,僅達到《中國藥典》2015年版規定水平,與秋季采收藥材品質佳的理論及龐金虎等[15]研究的結果相悖,分析原因,由于秋季的產品多糖、半乳糖醇量大于春季,在干燥時間過長致使有效成分苯乙醇總苷類物質被體內相應的酶水解16],有效成分大大降低["7,此外,筆者考察了2批質硬、體輕、色淡、柴性強(抽花序)的同一產地品相劣的春季采收藥材,指標成分總量均值為1.06%,卻遠遠高于秋季樣品。彭芳等[18]考察了外觀性狀差異不顯著的10株肉蓯蓉,松果菊苷含有量在0.18%~1.58%,相差近8倍,同時還發現不同批次指紋圖譜中的相似度相對較低[9)。由此可見,肉蓯蓉中松果菊苷及毛蕊花糖苷二者總量,在不同季節、不同批次、個體樣品間量波動較大、不穩定,甚至某些樣品中毛蕊花糖苷量低時僅千分之幾20,無法體現有效成分的量效規律及其內在品質。若以兩者總量作為指標成分,無法準確反映本品的客觀品質。因此,建議改為考察苯乙醇總苷的量較為合理。同時,本品含有豐富的甜菜堿,春季樣品量高達6.7%,而在考察中發現管花肉蓯蓉不含此成分。管花肉蓯蓉含有較高的苯乙醇苷類成分,具有較強的補腎陽和神經保護作用。而肉蓯蓉含有豐富多糖和半乳糖醇,具有較強的抗衰老和潤腸通便之功效。由.上述可知,兩者在基原、性狀特征、成分量及主治作用方面存在差異性,需制定更加客觀統一-的質控標準。


亚美AM83.3  藥典中對肉蓯蓉含水量的規定,缺乏合理性,限制了其在市場上流通使用肉蓯蓉習稱“軟蓯蓉”,具有“肉厚而力緊”“質柔潤者為佳”品質特征。本品長年生長在地下,為較典型肉質類藥材。表2顯示,秋季樣品含極豐富的多糖和半乳糖醇,分別達13.7%、19.5%。由于植物多糖的羥基和其他極性基團存在,具有較強的親水性,這使藥材在外觀上呈現“軟、質柔潤”性狀特征。筆者初步統計了藥典上收載常見的10個肉質類藥材規定的含水限量,玉竹為16%,黃精為18%,天麻為15%,地黃為16%,玄參為16%,天冬為16%,麥冬為18%,龍眼肉為15%,黨參為16%,當歸為15%,在正常儲存條件下,本品具有更強的吸濕性。因此,同為肉質類藥材,僅把肉蓯蓉含水限量規定為10%,顯然不合理。建議本品含水限量為16%,比較客觀、合理。此外,分析了2014年、2015 年采收的樣品以及在市場上收集的藥材,含水量均高于10%,為不合格藥材。因此,由于含水限量規定過于低,明顯限制了道地藥材肉蓯蓉在市場上流通和臨床上推廣使用。


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